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Casuarina equisetifolia et Allocasuarina verticillata sont deux espèces ligneuses de la famille des Casuarinaceae susceptibles d'établir une symbiose fixatrice d'azote avec un actinomycète, Frankia. L'étude de ces espèces sur le plan moléculaire a necessité, dans un premier temps, la mise au point de protocoles d'extraction d'acides nucléiques adaptés. Un protocole d'extraction d'ADN a été établi pour les deux espèces. Des protocoles d'extraction d'ARN à partir de différents tissus de C. equisetifolia ont été développés. Chez la plupart des espèces nodulantes (légumineuses et non-légumineuses), la présence d'hémoglobine dans les nodules a été mise en évidence. Et, pour quelques espèces dont les Casuarinaceae, de l'hémoglobine a également été détectée dans les racines. Il semblerait qu[...]

Casuarina equisetifolia et Allocasuarina verticillata sont deux espèces ligneuses de la famille des Casuarinaceae susceptibles d'établir une symbiose fixatrice d'azote avec un actinomycète, Frankia. L'étude de ces espèces sur le plan moléculaire a necessité, dans un premier temps, la mise au point de protocoles d'extraction d'acides nucléiques adaptés. Un protocole d'extraction d'ADN a été établi pour les deux espèces. Des protocoles d'extraction d'ARN à partir de différents tissus de C. equisetifolia ont été développés. Chez la plupart des espèces nodulantes (légumineuses et non-légumineuses), la présence d'hémoglobine dans les nodules a été mise en évidence. Et, pour quelques espèces dont les Casuarinaceae, de l'hémoglobine a également été détectée dans les racines. Il semblerait que, chez les Casuarinaceae, les hémoglobines extraites de nodules et de racines soient différentes. Mais aucun gène codant pour ces deux formes d'hémoglobine (symbiotique ou
racinaire) n'a été, à ce jour, identifié. Dans ce travail, nous avons cloné, par amplification en chaîne par polymérase (PCR), plusieurs fragments d'ADN correspondant à des gènes d'hémoglobine symbiotique, pour les deux espèces étudiées. En effet, les traductions protéiques des fragments obtenus sont très homologues à une région de la séquence publiée de l'hémoglobine extarite de nodule de C glauca. Et les fragments clonés s'hybrident spécifiquement avec l'ARN de nodule de C equisetifolia. L'observation des variations de séquence entre les différents fragments clonés par espèce et l'observation des profits d'hybridation de ces fragments sur l'ADN génomique des deux espèces (hydrolysé par différentes endonucléases) suggèrent l'existence d'une famille multigénétique codant pour l'hémoglobine symbiotique chez les deux espèces. Nous avons tenté d'utiliser les nombreuses connaissances aquises chez les légumineuses pour identifier, chez las Casuarinaceae, des gènes
spécifiquement exprimés lors de la nodulation (gènes de nodulines) : des oligonucléotides préparés à partir de la séquence d'un gène de noduline de légumineuse ont été utilisés dans des réactions d'amplification en chaîne par polymérase utilisant comme substrat l'ADN d'A. verticillata. Mais, cette approche n'a pas abouti. Un fragment d'ADN a été obtenu qui s'est avéré homologue à des gènes de Casuarinaceae très fortement exprimés dans les racines.
Dans l'objectif d'étudier la régulation de l'expression de gènes de noduline, il est utile de pouvoir transformer et régénérer l'espèce végétale étudiée. C'est pourquoi, un système de transformation génétique d'A. verticillata par Agrobacterium rhizogenes a été développé. Pour la production de racines transformées, la réponse de différents organes d'A. verticillata à l'inoculation par deux souches d'A. rhizogenes (2659 et A4) a été testée. Des bourgeons ont pu être régénérés à partir des racines transformées. Enfin, des plantes transformées (par le T-DNA d'A. rhizogenes 2659) viables et capables de nodulation ont été obtenues.
En application au système de transformation génétique mis au point, des constructions chimériques constituées de promoteurs dérivés de celui d'un gène d'hémoglobine de Sesbania rostrata et de la séquence codante du gène de la b-glucuronidase ont été introduites dans A.verticillata. L'expression des constructions dans les racines transformées a été étudiéee.
Première approche moléculaire du rôle de la plante hôte dans la symbiose Casuarinaceae-Frankia, ce travail ouvre de nombreuses perspectives d'avenir.