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Les polyphosphoinositides (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate : PIP2 et phosphatidylinositol 4-phosphate : PIP), phospholipides mineurs de la membrane des hématies sont l'objet d'un renouvellement rapide de leurs groupements phosphomonoesters, sous la dépendance de kinases et de phosphatases spécifiques. La membrane du globule rouge possède également une phospholipase C, spécifique des polyphosphoinositides, qui peut être activée en présence de concentrations supraphysiologiques de calcium.
Afin d'étudier ces activités enzymatiques dans les hématies entières, les cellules, une fois incubées en présence de |32P| Pi, sont chargées en Ca2+ et/ou Mg2+ grâce à l'utilisation d'un ionophore à cations divalents. L'hydrolyse du PIP et du PIP2 peut ensuite être étudiée en fonction des conce[...]

Les polyphosphoinositides (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate : PIP2 et phosphatidylinositol 4-phosphate : PIP), phospholipides mineurs de la membrane des hématies sont l'objet d'un renouvellement rapide de leurs groupements phosphomonoesters, sous la dépendance de kinases et de phosphatases spécifiques. La membrane du globule rouge possède également une phospholipase C, spécifique des polyphosphoinositides, qui peut être activée en présence de concentrations supraphysiologiques de calcium.
Afin d'étudier ces activités enzymatiques dans les hématies entières, les cellules, une fois incubées en présence de |32P| Pi, sont chargées en Ca2+ et/ou Mg2+ grâce à l'utilisation d'un ionophore à cations divalents. L'hydrolyse du PIP et du PIP2 peut ensuite être étudiée en fonction des concentrations de ces cations. L'étude de l'activité des phosphomonoesterases et des phosphodiesterases (enzymes responsables des hydrolyses des PPI) a été facilitée en travaillant sur cellules appauvries en ATP, conditions dans lesquelles l'activité des kinases est supprimée. La plupart des résultats connus et obtenus sur membranes isolées ou enzymes purifiées ont ainsi pu être confirmés, voir même complétés, in situ, sur cellules intactes : activités Ca2+- dépendante et Mg2+- indépendante de la phospholipase C, activité Ca2+- et Mg2+- indépendante de la PIP phosphomonoesterase par un des sucres biphosphates dont la concentration augmente lors de la déplétion des cellules en ATP.
Par ailleurs nous sommes parvenus (objectif majeur de mon stage) à isoler par HPLC l'un des produits spécifiques de l'activation de la phospholipase C, l'inositol 1,4,5-triphosphate (IP3). Dans un premier temps, l'optimisation de la composition du tampon d'élution nous a permis d'améliorer sensiblement sa séparation des autres composés également marqués par le 32p. Ensuite, l'étude de la production d'IP3 en fonction des concentrations du milieu en MgCl2 et CaCl2, nous a permis de confirmer la dépendance pour le Ca2+ de la phospholipase C et la dépendance pour le Mg2+ de l'activité IP3 phosphomonoesterase. Dans de nombreuses cellules, l'IP3 est un second messager produit lors de l'activation de certains récepteurs membranaires, qui provoque une libération de calcium intracellulaire. Sa production est communément le cas des plaquettes qui n'incorporent pas ce composé. La mise au point méthodologique effectuée ici constituera donc une grande aide pour l'étude des premières étapes de l'activation plaquettaire. (résumé de l'auteur)