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La cryoconservation, consistant à conserver du matériel végétal dans l'azote liquide, est une technique essentielle à l'embryogenèse somatique des résineux. Elle permet de préserver et sécuriser à long terme les masses embryonnaires (ESM) dans un état physiologique et sanitaire stable, pendant qu'une évaluation et une sélection des clones performants sont effectuées par l'intermédiaire de tests clonaux. Les génotypes sélectionnés pourront alors être multipliés à grande échelle à partir des échantillons congelés. Trois protocoles de cryoconservation coexistent : le protocole de l'AFOCEL, un protocole développé par des équipes scandinaves et le protocole de Kartha, qui est de loin le protocole le largement utilisé de part le monde. Ils sont utilisés en routine sans jamais avoir été étud[...]

La cryoconservation, consistant à conserver du matériel végétal dans l'azote liquide, est une technique essentielle à l'embryogenèse somatique des résineux. Elle permet de préserver et sécuriser à long terme les masses embryonnaires (ESM) dans un état physiologique et sanitaire stable, pendant qu'une évaluation et une sélection des clones performants sont effectuées par l'intermédiaire de tests clonaux. Les génotypes sélectionnés pourront alors être multipliés à grande échelle à partir des échantillons congelés. Trois protocoles de cryoconservation coexistent : le protocole de l'AFOCEL, un protocole développé par des équipes scandinaves et le protocole de Kartha, qui est de loin le protocole le largement utilisé de part le monde. Ils sont utilisés en routine sans jamais avoir été étudiés en comparaison. Nous avons donc mis sur pied un schéma expérimental visant à l'étude comparative des trois protocoles chez Pinus pinaster. Les résultats obtenus sur cinq
clones n'ont pas révélé de différence significative d'efficacité entre les protocoles. La durée de la phase de latence après décongélation des cellules ne dépasse cinq jours pour aucune des procédures. La majorité des ESM retrouve une morphologie similaire aux témoins non cryoconservés en trois semaines, mais certains clones mettent plus de deux mois avant de retrouver une morphologie identique aux témoins. Cet effet clonal semble corrélé au taux de multiplication avant cryoconservation. Une technique alternative reposant sur l'enrobage dans des billes d'alginate a également été testée. Le laps de temps imparti à ce stage ne nous a permis que d'effleurer la mise en oeuvre de ce procédé, mais il semble pouvoir devenir la solution idéale pour la cryoconservation à long terme. Il permet en effet, entre autres avantages, de se passer d'appareillage permettant une descente progressive en température. Le matériel cryoconservé supporte facilement les à coup de gel -
dégel et le contenu d'un seul cryotube peut être utilisé pour des dizaines de réactivations. Une maturation et une analyse moléculaire des plantes réactivées en comparaison avec du matériel non cryoconservé permettraient de tester la conformité des plants issus des différents protocoles. Si aucune différence de fréquence d'apparition de variations somaclonales n'est détectée entre protocoles, on choisira finalement la technqiue la plus simple, la plus rapide et la moins coûteuse à mettre en oeuvre.