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Les cultures axéniques du champignon ectomycorhizien Laccaaria bicolor S238N en fermenteur, qui servent à la production d'inoculum destiné aux pépinières forestières dans le cadre de la mycorhization contrôlée du Douglas, présentent depuis quelques années des contaminations bactériennes récurrentes. L'hypothèse d'une origine intracellulaire de ces "contaminants" a été proposée sur le modèle des champignons endomycorhiziens et d'un autre champignon ectomycorhizien, Tuber borchii. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons combiné deux approches, l'hybridation in situ et la PCR. Des expériences de co-localisation de sondes spécifiques de l'ARNr 16S bactérien par hybridation in situ, associées à la microscopie confocale, ont permis de mettre en évidence des structures intracellulaires con[...]

Les cultures axéniques du champignon ectomycorhizien Laccaaria bicolor S238N en fermenteur, qui servent à la production d'inoculum destiné aux pépinières forestières dans le cadre de la mycorhization contrôlée du Douglas, présentent depuis quelques années des contaminations bactériennes récurrentes. L'hypothèse d'une origine intracellulaire de ces "contaminants" a été proposée sur le modèle des champignons endomycorhiziens et d'un autre champignon ectomycorhizien, Tuber borchii. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons combiné deux approches, l'hybridation in situ et la PCR. Des expériences de co-localisation de sondes spécifiques de l'ARNr 16S bactérien par hybridation in situ, associées à la microscopie confocale, ont permis de mettre en évidence des structures intracellulaires contenant de l'ARNr 16S caractéristique de bactéries du groupe des Gram positives à faible contenu en GC. Elles sont sphériques, de moins d'un micromètre de diamètre, rares et
réparties de manières hétérogène dans certains articles uniquement. Après un long travail de mise au point , nous avons proposé un protocole optimisé au cas de L. bicolor pour l'échantilonnage, l'extraction d' ADN et l'amplification par PCR d'un fragment d' ADNr16S eubactérien à l'aide d'amorces spécifiques. Ce protocole nous a permis d'amplifier à partir d'une jeune culture du champignon sur milieu gélosé, un fragment d' ADNr 16S qu'il va falloir à présent séquencer. La séquence obtenue permettra de définir une sonde spécifique des bactéries recherchées, indispensable pour confirmer la nature bactérienne des signaux observés par hybridation in situ. Elle permettra aussi d'identifier ces bactéries. Par ailleurs, une estimation calculée de la concentration en ADNr bactérien dans l'échantillon de mycélium qui s'est révélé posotif a montré que cette concentration est proche du seuil de détection, ce qui permet d'expliquer les nombreux échecs de nos tentatives
d'amplification de l'ADNr 16S par PCR. En perspective, nous envisageons, après mise au point d'une technique de détection très sensible et utilisable en routine, d'étudier l'écologie et le rôle de ces bactéries, notamment leur impact sur la symbiose ectomycorhizienne, puis d'évaluer la généralité de l'endosymbiose bactérienne chez les champignons ectomycorhiziens.